利用密度梯度超速离心法从水稻幼苗中分离和富
获得高质量的高尔基体分离物，对于进一步分析和理解这种细胞器至关重要。Himac 目前隶属于 Eppendorf集团，拥有 60 多年定制研发落地式的丰富经验。在本应用说明中，我们将采用一系列差速离心和非连续蔗糖密度梯度离心操作，使用 Himac CP80-NX离心机（搭配 P32ST 和 P40ST 水平转子）从水稻幼苗中分离高尔基体。
图 1：搭载 P32ST 和 P40ST 型水平转子的 CP 系列
120 多年前，卡米洛 · 高尔基（Camillo Golgi）首次发现了真核细胞的高尔基体。之后，（电子）显微技术的发展揭示了高尔基体的复杂结构，而进一步的生化分析则阐明了细胞内这种细胞器的各项功能 [2]。在高等生物细胞中，作为分泌途径的一部分，高尔基体负责合成复合多糖体、加工蛋白质并将蛋白质分配到其他细胞器中（图 2）[1]。
叶绿体蛋白质的转运机制
(1) 通过TOC-TIC复合体的正常转运途径
(2) 通过分泌途径的特殊转运途径（ER-高尔基体）
图 2：植物细胞通过以下途径完成蛋白质转运：
（1）罢辞肠-罢颈肠复合体转运机制（2）高尔基体和分泌途径
α- 淀粉酶就属于此类蛋白质，它是一种负责植物内淀粉分子水解的糖苷酶。研究表明，α- 淀粉酶在内质网（ER）核糖体处合成并在内质网内腔中糖基化后被输送到高尔基体进行低聚糖改性 [3]。然而，由于高尔基体与内质网（ER）等其他膜系统形成了复杂结构 [2]，因此分离这种细胞器的不同部分尤其困难。事实上，高尔基体膜的某些部位还经常会被液泡等其他相连的膜系统污染 [2]。因此，在本应用说明中，我们将使用一系列差速离心和密度梯度离心操作（富集特定膜系统的最成熟技术之一）[2]，从水稻幼苗中获取高尔基体膜。用这种技术可以获取高纯度、高质量提取物并用于质谱等进一步的下游分析。下面我们将详细介绍使用 CP80-NX 超速落地式离心机（搭配 P32ST 和P40ST 转子）分离获取高质量高尔基体的过程。
材料与方法
所用材料
CP80NX 超速离心机搭配以下水平转子：
1. P32ST 型水平转子，适用于 40 mL PET 离心管
2. P40ST 型水平转子，适用于 13 mL PET 离心管
第 1 步：
使用 P32ST 型水平转子 （40 mL PET 离心管） 和 P40ST 型水平转子 （13 mL PET 离心管），完成微粒体纯化过程。
1. 在 4°C 条件下，使用水平转子，在 40 mL PET 离心管中以15,000 x g 的速度离心纯化水稻提取物 30 分钟，并移除沉降物。
2. 在 13 mL PET 离心管中，底部铺垫 1 mL 50% 浓度蔗糖溶液，中间层装入 1 mL 15% 蔗糖溶液，顶部装入 11 mL 上清液。15% 蔗糖溶液置于 1 mL 50% 蔗糖垫层之上，将11 mL 上清液装入 1 mL 15% 蔗糖溶液顶部。
3. 在 4°C 条件下，以 100,000 × g 的离心力离心 3 小时，然后收集 50% 蔗糖垫层溶液中截留的微粒体部分。
第 2 步：
使用 P40ST型水平转子 （13 mL PET离心管），从微粒体部分纯化高尔基体。
1. 使用手持糖量仪，利用 60% 蔗糖缓冲液将收集的微粒体蔗糖溶液密度中和至 42%。在该溶液上层装入 1-2 mL 其他非连续蔗糖密度梯度，每个梯度由 1 mL 浓度为 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖层组成。随后，小心地加满水至13 mL。
2. 4°C，100,000 × g 离心 3 小时，然后迅速收集漂浮在34% 和 38% 蔗糖层之间界面相的高尔基体部分（1）。
3. 再次将收集的高尔基体部分中和至蔗糖密度 42%，然后再次装入 1-2 mL 不连续的蔗糖梯度溶液，每个梯度由 1 mL 26%、30%、34% 和 38% 的蔗糖层组成。小心加满水至13 mL。
4 .4°C， 100,000 × g 离心 3 小时，然后收集漂浮在 34% 和38% 蔗糖层之间界面相的高尔基体部分（2）。
通过使用细长的 13 mL 离心管完成两次浮选离心，即可从微粒体中分离出高纯度的高尔基体。回收后的高尔基体部分（2）可用于实验和印迹分析。所有蔗糖浓度单位均为质量百分比（w/w）。
结果与讨论
非连续密度梯度离心法是分离或富集亚细胞成分的标准方法。在大多数情况下，我们利用沉降系数或特定密度的差异来获得分离物。在细胞器的分离应用中，决定这些分离参数的主要因素是相应膜的组成成分。获得高纯度的分离物通常比较困难，这一点在与其他膜系统紧密相连的高尔基体 [2] 上尤为明显。
因此，高纯度的高尔基体膜对于分析和研究高尔基体蛋白质组 [1] 或细胞器内特定的蛋白质至关重要。
本文使用了两种不同型号的水平转子，配合一系列非连续蔗糖密度梯度离心步骤，高效可靠地获得了高质量的高尔基体分离物。
在弃掉第一道离心步骤中的细胞碎片后，将上清液装入第一个非连续的蔗糖梯度上（见图 3）。在 15% 和 50% 的蔗糖相之间为富集的微粒体部分。随后，微粒体部分通过两次非连续的蔗糖梯度浮选分离步骤而进一步被纯化，其中高尔基体沉积在梯度为 34% 和 38% 的蔗糖相之间（图 3）。Asakura 等人 [4] 的研究表明，经过第二次浮选分离操作后，高尔基体部分的纯度显著提高。可以采用免疫印迹法对以下标记酶进行检测，进而对高尔基体的质量进行分析：例如 UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶：细胞质基质）、RbcL（二磷酸核酮糖羧化酶 长链：质体）、COXII（细胞色素 C 氧化酶亚基 2：线粒体）和 ARF（腺苷核糖基化因子：高尔基体）。
结论
水平转子 P32ST 和 P40ST 是分离高尔基体的理想选择，两者搭配可以实现从 40 mL 大容量离心管到 13 mL 小容量离心管的流畅切换，同时保证了优秀的离心效果。Himac 13 mL PET离心管采用了特殊的细长造型，可实现更长的浮选距离，从而提升了高尔基体部分的纯度。此外，转子采用的顶部装载设计，便于完成蔗糖梯度处理的精细操作，并且可以将意外混合污染的风险降至最低。
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